HIV抗体确认实验

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HIV抗体确认实验

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HIV抗体确认实验

作者：佚名文章来源：不详点击数：更新时间：2005-6-13

根据卫生部规定，HIV-1抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确认实验室出具才有法律效应。

最常用的HIV-1抗体确认实验方法是免疫印迹法（Wwstern Blot,WB）和条带免疫印迹法（Strip Immunoblot Assay, SIA或Linear Immunoblot Assay, LIA）,其中以WB法最常用。

1. 免疫印迹实验：用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原，也是目前国内HIV抗体确认的首选方法，他能同时检测不同HIV-1抗原组分的抗体，因此能够鉴别或肯定初筛检测的结果。　

2. 条带免疫印迹法：工作原理和操作方法与WB实验基本相同，只是条膜上抗原来源和组成有所区别。检测时信噪比高，本地清晰，无潜在假阳性干扰，且可通过调整条膜上HIV抗原量，克服了WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的固相载体上某些重要抗原量不足的缺点。这类试剂特异性很高，但也可能由于病毒株在所合成抗原决定簇部位发生突变导致HIV抗体假阴性结果；另一个缺点是由于合成抗原不能糖基化，其立体构像与天然抗原分子有一定差异，在一定程度上可能影响了模拟真实HIV抗原检测抗体的能力。

HIV-1抗体确认实验结果的评价  免疫印迹实验的结果是根据硝酸纤维素条膜特异性HIV抗原位置上出现的带型不同来判断HIV抗体为阳性、阴性和不确定。

阳性和阴性结果的判断标准：美国CDC的标准为国际公认。

         阳性和阴性结果的判断标准

HIV-1抗体阳性                 HIV-1抗体阴性

仅gp41                        没有条带；零星条带

Gp120/gp160加上gp41或P24


HIV抗体不确定（或可疑）结果的评价  在某些情况下，样品显示不典型的HIV反应性条带图谱，既不能确定为阳性也不能确定为阴性，称为HIV抗体不确定或可疑阳性。

以下原因可能导致HIV-1抗体不确定结果的出现：①HIV-1急性感染后，抗体刚出现，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA往往已显示阳性反应；②非特异反应，如在高丙球蛋白血症，某些病毒性疾病和寄生虫感染，自身免疫性疾病等情况下可出现该现象；③极少数晚期艾滋病患者；④与HIV裂解物中的宿主细胞成分发生交叉反应；⑤样本交叉污染。

对HIV抗体不确定的受检者必须进行随访，通常为每3个月1次，共随访2次。如随访过程中出现特异性HIV抗体反应条带如gp160或120，则做出HIV-1抗体阳性结论。如随访6个月后带型消失或没有变化，则做出HIV抗体阴性报告。

    病毒载量的检测及其意义

    在HIV的各种检测中，其中一项为病毒水平定量检测。它包括HIV-1 p24抗原定量检测、血浆/淋巴细胞中病毒培养定量检测、血浆中病毒RNA定量检测及淋巴细胞cDNA定量检测。其中较为敏感、准确的方法应为血浆中病毒RNA定量检测法。

它可以准确的测定出每毫升血浆中HIV RNA的含量。

    自90年代初，血液中HIV RNA的定量检测已被公认为可以预估病人病程，并可利用于鸡尾酒疗法的效应的评估。利用病毒载量可在病人急性感染期间，处于空窗期时即可检测出高水平的病毒RNA含量。医师可利用结果判定病人疾病的进程和进展，以及可在接受抗病毒治疗过程中起监测与指导作用。可以在开始治疗前对病人进行HIV RNA水平检测，治疗过程中通过对HIV RNA的一系列测定来指导治疗。例如，如果RNA水平没有降低，那么就应该调整治疗或改变治疗方案；如果RNA复制受到抑制，那么就应持续治疗。

病毒载量检测主要有三种方法：bDNA、RT-PCR及NASBA。bDNA是一种核酸检测技术，它属于信号扩增，而RT-PCR及NASBA则属于靶扩增。bDNA检测中，靶探针是与HIV基因组中的pol基因序列特异性结合，此段序列为所有已知的HIV基因中最保守的区域。RT-PCR检测是通过逆转录(RT)及扩增(PCR)完成特异性扩增HIV gag基因的一段长为142bp的基因序列。由于每个样本中QS的量已知，在扩增及检测后可通过对光密度结果的比较，运用公式计算出HIVRNA拷贝数，从而达到HIV RNA定量的目的。NASBA检测是通过核酸释放、提取(固相提取)，核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测(ECL检测)来完成对血浆/血清中HIV病毒RNA的定量测定。RT-PCR、NASBA检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染，而使RNA降解。bDNA与RT-PCR、NASBA相比较有较好的稳定性、线性和可重复性。

血浆中HIV RNA的定量分析，可表现出病毒复制动力学，也反应血浆中游离病毒的浓度，是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，因而在判定疾病进程和判定临床治疗效果上具有极大的价值。

CD4、CD8细胞计数及其意义

在T淋巴细胞分类中，CD4代表T辅助细胞而CD8代表T抑制细胞和T杀伤细胞。CD4+T淋巴细胞是HIV感染的主要靶细胞，而其本身又是免疫反应的中心细胞；CD8+T淋巴细胞是免疫反应的效应细胞。正常人的CD4+T淋巴细胞约占总的T淋巴细胞的65%，CD8+T淋巴细胞约占35%。人体感染了HIV后，涉及的主要病理过程就是免疫系统的损害，主要表现为：CD4+T淋巴细胞的丢失，绝对数量的减少，同时CD8+T淋巴细胞数量增加，CD4和CD8的比例失调。因此CD4+，CD4+T淋巴细胞记数作为直接测定免疫功能的方法，是提供HIV感染病人免疫系统损害状况最明确的指标。

流式细胞术计数法原理

    流式细胞术(FCM)是对细胞和微粒进行快速、灵活、定量分析分类的高精技术，它融合了激光、电子计算机、单克隆抗体、荧光素化学、细胞化学染色等技术的优点。其基本原理是以激光为光源，将被检细胞用荧光标记抗体结合后输入流式细胞仪，通过高速流动系统对细胞排列成行，一个一个的流经检测区，当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀的小滴，每滴内最多只含有一个细胞，细胞经荧光探针的光反应和标记物的光散射能力中获取信息，由光电倍增管接收并转化成脉冲信号，并进行增强，数据经电脑处理、分辨细胞的类型从而检测出各类淋巴细胞。

CD4+T淋巴细胞记数测定的主要意义：

① 用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴细胞＜200/mm3或CD4+T淋巴细胞的百分比＜14%的HIV感染者可归入艾滋病。

② 判断HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性），如CD4+T淋巴细胞＜200/ mm3时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞＜50/mm3的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞＞100/mm3的病人。

③ 帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞＜200/ mm3时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗。

④ 抗HIV药物疗效的重要判断指标。

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